梯度洗脫可用于處理不能以等度洗脫分離的樣品，而最常見的使用梯度的因素是多成分保留能力不同，無法在等度洗脫中全洗脫出來，或以等度方式無法達到滿意的分離效果?？偨Y(jié)下來，以下幾種情況，可以采用梯度洗脫：

1、多組分樣品的極性范圍大，用等度無法全部洗脫的樣品；

2、大分子樣品；

3、改善峰峰型；

4、目標峰出峰后，短時間內(nèi)提高有機相比例，洗脫強保留干擾雜質(zhì)；

5、用等度洗脫無法達到分離的情況。

具有不同保留值范圍的多組分，無法使用同一個等度wan全洗脫下來。用同一個等度，會出現(xiàn)要么部分成分無保留沒法分離，部分強保留無法洗脫下來，或一針洗脫時間過久的問題，這種情況下，選擇梯度洗脫，使流動相洗脫能力從弱到強，從而達到不同保留值范圍的多組分在同一個條件下實現(xiàn)分離。

大分子量樣品（肽、蛋白質(zhì)、合成聚合物等）一般采用梯度洗脫分離會更好，尤其是反相條件。這類樣品，往往對有機相的量特別敏感，有機相的微小變化就會使樣品的保留時間發(fā)生很大的變化，導(dǎo)致用等度條件檢測時，無法使保留時間控制在一個穩(wěn)定合適的范圍內(nèi)。

有些成分，在使用等度洗脫時，峰型不佳，不能滿足檢測需求，這種時候，可以采用梯度洗脫來改善峰型。因此，哪怕是單一成分的含量測定，有時也會用到梯度洗脫進行測定。

示例：4-哌啶甲酸的檢測